有機(jī)磷殺蟲劑抑制昆蟲乙酰膽堿酯酶活性測定

有機(jī)磷殺蟲劑抑制昆蟲乙酰膽堿酯酶活性測定
目的要求
    通過本試驗(yàn)了解有機(jī)磷殺蟲劑對昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用。由于乙酰膽堿累積，神經(jīng)受過度刺激，膽堿能系統(tǒng)破壞（或受阻），而引起昆蟲中毒以致死亡。
    本試驗(yàn)采用酶化學(xué)比色法測定受藥處理后中毒昆蟲酶被抑制程度。此原理也可應(yīng)用于對農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷殺蟲劑殘留分析和有機(jī)磷中毒病人血液中膽堿酯酶活性的 測定。
原理
    當(dāng)有機(jī)磷殺蟲劑與乙酰膽堿酯酶相互作用時(shí)，乙酰膽堿酯酶被抑制，不能水解乙酰膽堿，昆蟲體內(nèi)乙酰膽堿累積，從而致使中毒。
    本法以有機(jī)磷處理昆蟲后，取昆蟲頭部研磨成勻漿液作酶源，與定量的乙酰膽堿再一定條件下，經(jīng)該酶水解后剩余的乙酰膽堿與堿性羥胺作用生成異羥虧酸，再與三氯化鐵作用生成羥虧酸鐵絡(luò)化合物（紅棕色）。用分光光度計(jì)測定其光密度值。如酶被抑制高時(shí)，剩余的乙酰膽堿多，光密度值大，反之，則光密度小。
實(shí)驗(yàn)材料
    試劑：
    ①磷酸鹽緩沖液  稱取純結(jié)晶磷酸氫二鈉16.72g及磷酸二氫鉀2.72g，以重蒸餾水溶解并注入倒1000ml容量瓶中，PH7.2。
    ②0.004M溴化乙酰膽堿溶液 準(zhǔn)確稱取溴化乙酰膽堿0.1809g，以磷酸鹽緩沖液溶解并注入到200ml容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液至刻度。
    ③2M鹽酸羥胺溶液 稱取鹽酸羥胺13.9g溶于100ml重蒸餾水中。
    上述三種試劑配制后均存入冰箱中備用
    ④3.5M氫氧化鈉溶液  稱取氫氧化鈉14g溶于100ml蒸餾水中。
    ⑤1：2鹽酸溶液  用化學(xué)純鹽酸1份加蒸餾水2份
    ⑥0.37M三氯化鐵溶液  稱化學(xué)純六水三氯化鐵100g溶于0.1M HCl溶液中，最后定容至1000ml
    實(shí)驗(yàn)用具：玻璃勻漿器、攪拌機(jī)、小剪刀、水浴控溫?fù)u床（或恒溫水浴箱）、玻璃絲、10ml試管、721分光光度計(jì)、0.5、1.0、2.0ml吸液管等。
    酶的制備：以5％敵敵畏丙酮液在每頭昆蟲的 胸背板處點(diǎn)滴2微升（供試?yán)ハx可用粘蟲、棉鈴蟲等），處理后約經(jīng)30-0分鐘，當(dāng)昆蟲中毒并接近死亡時(shí)，立即用小剪刀剪下20頭昆蟲頭部盛于玻璃勻漿器內(nèi)（預(yù)先吸入約3ml冰冷的磷酸緩沖液），在低溫條件下進(jìn)行勻漿，以少量玻璃絲置于小型漏斗上把蟲漿過濾，濾液用磷酸鹽緩沖液定容至5ml，暫儲存于冷凍室內(nèi)備用。
    另取20頭正常（無藥處理）昆蟲頭部，勻漿處理與上述藥劑處理組相同。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
    取試管12支分為6組，用吸管分別注入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2ml的試劑②于各組已作標(biāo)記試管中，并分別加入試劑①至試管中，使各管的溶液總量為1.5ml。然后將1-5組試管分別加入2ml試劑③加入④混合液（按1：1比例臨時(shí)混合），用力搖動(dòng)1分鐘，加入1ml試劑⑤搖勻，加入1ml試劑⑥，搖勻后呈現(xiàn)深淺不同顏色。第六組試管在加入試劑①至總量達(dá)1.5ml后，先加入試劑⑤1ml，搖勻后加入2ml試劑③加④混合液（按1：1比例臨時(shí)混合），搖勻后加1ml試劑⑥，搖勻即成空白管。
樣本分析
   取潔凈的試管9支，編號為1（1）、1（2），（指正常蟲管）；2（1）、2（2），（指正常蟲對照管）;3(1) 、3(2),（藥劑處理管）；4（1）、4（2），（藥劑處理對照管）；5（空白管）。于各試管中加入1ml試劑②，1與3管各加0.5ml正常蟲和藥劑處理后的 蟲漿，5號管加入0.5ml磷酸鹽緩沖液，搖勻后置于預(yù)先調(diào)好為37度的恒溫水浴搖床里40分鐘。除空白管外，其它各管應(yīng)立即加入2ml試劑③加④混合液（按1：1比例臨時(shí)混合），用力搖動(dòng)1分鐘以上，2對4對照管分別加入正常蟲和藥劑處理蟲的 蟲漿液各0.5ml。搖勻后加試劑⑤1ml，搖勻后再加試劑⑥1ml，搖勻后用濾紙過濾，空白管的制作同標(biāo)準(zhǔn)曲線中的空白管制作相同。

測定和結(jié)果整理
     把標(biāo)準(zhǔn)或樣本按制作步驟完成后，將濾液分別移至各比色杯中，用分光光度計(jì)在波長540微米下進(jìn)行測定。以空白管調(diào)節(jié)光密度為“0”，分別測定標(biāo)準(zhǔn)或樣本管并讀出它們的光密度數(shù)值。
     以不同濃度的乙酰膽堿量（微克分子濃度）數(shù)值做橫坐標(biāo)，各管測得的光密度做縱坐標(biāo)即可繪制成一標(biāo)準(zhǔn)曲線。把測定樣本的 光密度值可從標(biāo)準(zhǔn)曲線坐標(biāo)上求出樣本的乙酰膽堿量。從而代入公式，求乙酰膽堿酶被抑制百分率（％）。
     受藥后5齡粘蟲（頭部）乙酰膽堿酯酶被抑制率（％）：
  酶被抑制率（％）＝【正常蟲酶活性（水解ACh量）-受藥蟲酶活性（水解Ach量）】/正常蟲酶活性（水解ACh量）×100

哎呀，太專業(yè)了，不懂，還是要頂一下

這幾個(gè)貼還真是有夠?qū)�業(yè)的